Molekula genetika esploro metodo

Por esplori kaj identigi variantoj en DNA strukturo uzita molekula genetika metodo. Por ĉiu DNA regiono, kiu esploras ĉi tiu regiono de la kromosomo, geno aŭ alelo, la metodoj malsamas. Fundamentaj ĉiu molekula genetika metodo konsistas iuj aŭ aliaj manipulado de RNA kaj DNA. Ĉiuj ĉi tiuj metodoj estas karakterizitaj de enorma komplekseco, sen laboratorio kondiĉoj ne povas esti realigita, kaj la bastonon devas esti tre kvalifikita. Tiu laboro estas aranĝita en pluraj stadioj.

stadioj

Unue, RNA aŭ DNA specimenoj por esti produktitaj. Ĉi tie, molekula genetika metodo povas esti aplikita al preskaŭ ajna materialo: guton da sango, leŭkocitoj, fibroblastos kulturo, mukozo (skrapis), eĉ la haroj folikloj, - DNA povas esti ricevita de ajna specimeno. Ĝi taŭgas por uzi ajnan molekula genetika metodoj kaj iliaj diversaj opcioj kaj longe izolita DNA estas stokita frostigita. La dua stadio estas dediĉita al la amasiĝo de la deziratan fragmentoj (amplifado) de DNA, kiel ĝi helpas certigi la PĈR en vitro (en vitro sen partopreno de vivanta organismo). Rezulte, la elektitaj DNA fragmento multiplikas por tiu ĉeno reago, kaj la kvanto de DNA kreskas laŭvorte milionoj da fojoj.

La tria paŝo en la molekula genetika esploro metodoj supozas multiplikita DNA limigo (ĉi tiu fragmentación, ŝirante aŭ kortego). Limigo farita fare elektroforezo en polyacrylamide aŭ agarose ĝelo. Tiu molekula-genetika metodo studi la DNA fragmento permesas ĉiuj preni certan pozicion en la ĝelo. Poste, la ĝelo estas traktita kun ethidium bromuro, kapabla de kunigi al la ADN, la radiado kun transviola lumo, do ĝi eblas observi luminesko parton. Molekula genetika diagnozaj metodoj estas diversaj kaj multnombraj, sed la unuaj du ŝtupoj estas komunaj al ĉiuj. Sed por identigi DNA fragmentoj, la ĝelo povas esti koloraj, kaj multaj aliaj ekzistantaj metodoj.

specioj

La plej rekta kaj disvastigata metodoj por detekti micobacterias povas inkluzivi la supre molekula genetika DNA lernado metodo. Lia esenco estas ke, por identigi la scintigrafio ĉeno materialo de specifaj fragmentoj de ADN de patogenoj. Molekula genetika diagnozaj teknikoj ankoraŭ ne havas pli efikan manieron rekoni tiajn malsanojn kiel tuberkulozo. Uzante la PĈR (PCR), vi povas esti certa, ke la origina DNA pliigos la nombron de kopioj en miliono fojojn, tio estas, estos amplificación, kaj ĝi montros la rezultojn. La sentiveco nivelo estas tre alta - pli ol naŭdek kvin procento, kiu estas la ĉefa avantaĝo de ĉi tiu metodo.

La resto de la molekula-genetika metodoj de esploro sur la efikeco de rendimento multoblajn kopiojn laŭvorte duobliĝis, ĉar en ĉi tiu kazo la redakcio specimeno montras specifan oligonucleotide sinsekvo pliigis al cent ses fojojn. Eĉ la kulturo diagnozo de tuberkulozo de la spira sistemo signife malaltigi lian sentivecon. Tial moderna medicino estas bazita sur molekula genetika metodoj de diagnozo de tuberkulozo. A priskribita metodo estas efika speciale kiam kontraktanta kun patogenoj de alta antigénica variabilidad, determini ke alia vojo estas multe pli malfacila - postulas specialajn nutraĵo amaskomunikiloj kaj kultivi delonge. Biokemio kaj molekula genetika metodoj produkti tre malsamajn efikon al la rezultoj.

diagnozo de tuberkulozo

Marŝala PCR diagnozo de tuberkulozo plej kutime uzas tiujn DNA sekvencoj kiuj estas specifaj por ĉiuj kvar tipoj de la malsano. Por atingi tiun celon ofte uzas manlibroj kiuj detektas sinsekvo ESTAS elementoj (ESTAS-986, ESTAS-6110), kiel tiuj elementoj karakterizas tre migranta specio Mycobacterium tuberkulozo kaj ĉiam ĉeestis plurajn kopiojn de la genoma. Ankaŭ DNA eltiro povas esti efektivigita de pura kulturoj kaj Klinika (sputum de pacientoj) de iu alia taŭga metodo. Ekzemple, ekzistas Eksplodo metodo kie la lisis bufro estas uzata surbaze de la guanidine tiocianato kaj siliko kiel la portanto DNA. La nombro de pacientoj kiuj diferencas malriĉa bakteriologiaj kreskanta ĉiujare, kaj tial en oportuna kliniko establis tute malsama nivelo de organizo: molekula-genetika metodo studi DNA estis ludanta gravan rolon en la diagnozo.

Tamen, ni devas konfesi, ke ĝi ne estas sen malavantaĝoj. La PCR metodo estas la uzo de ofte alportas grandegan nombron de falsaj-pozitivaj rezultoj, kaj la kialo estas ne nur teknika eraroj, sed ankaŭ la trajtoj de la metodo mem. Krome, uzante ĉi tiu metodo de diagnozo por determini la daŭrigeblecon de micobacterias, kiu estis identigita, ĝi estas simple neebla. Sed ĉi malavantaĝon ne estas la plej grava. Molekula genetika metodoj de PCR diagnozo kunportas la riskon de kontaminado de mycobacterial DNA. Atestado postuloj tial ke por PCR laboratorioj desegnita ekskluzive forte, ili postulas tri apartaj premisoj. PCR teknologio moderna kaj tre kompleksa, ĝi postulas la uzon de taŭga teamo kaj alta-trejnita personaron.

bacterioscopy

Kiam la diagnozo rezultoj de la analizo devas esti komparata kun aliaj datumoj: klinikaj ekzameno, radiografado, malprestiĝo mikroskopio, kropo kaj eĉ respondon al specifa traktado estas tre grava. En ĉi tiu serio, la PCR studoj estas nur unu el la komponantoj. Detekti la patógeno en la frua diagnozo povas esti la plej simpla kaj plej rapida metodoj - bakteriologiaj.

Tie estas uzata lumo mikroskopo (koloriganta Ziehl-Neelsen) kaj fluoreska (kolorigo fluorochromes). La avantaĝo estas rapido malprestiĝo la rezultojn. Sed ĝia malavantaĝo estas prave konsiderata la limigita kapablo pro malalta sentiveco. Tamen, ĉi tiu metodo donas WHO rekomendo kiel la plej ekonomia kaj la tero por detekti tuberkulozo pacientoj. Detección de micobacterias bakteriologiaj metodo havas antaŭdiron valoro kaj taksis kvante bakteria excreción. Multe pli certa trakti ŝin molekula genetika esploro metodoj de tuberkulozo.

kulturoj

Pli bona malkaŝo de micobacterias rekoni kulturajn studoj. Semas patologian materialo ĝi estas farita en la ovo meza: Mordovsky, finno II, LiveJournal, kaj similaj. Normoj de rezisto de micobacterias al medikamentoj kaj nerekta pruvo de la efikeco de kelkaj micobacterias kaj iliaj kolonioj en vitro, se la aplikata metodo de esploro kulturo. Pliigi la procenton de izolado de micobacterias inoculación de patologia materialo estas tenita sur multnombraj medioj.

Renkonti la bezonojn de multnombraj kulturaj, patógeno inkluzive subvencio kaj fluidoj. Uzata en ĉi tiu sistemo kaj aŭtomata mezurado tipo VANTES kreskon. Kultivaĵoj devas kateni la kovado por ĝis sep al ok semajnoj. Jam la kropon kun la manko de kresko povas esti konsiderita negativa. La plej efika maniero por detekti Mycobacterium tuberkulozo konsideri biologiaj specimenoj: diagnoza materialo infekti kobajoj, kiuj estas ekstreme sentemaj al TB.

kelkaj ciferoj

Interesaj kampo de studo, kiu estis malfermita por PCR diagnozo estis studi la M. tuberkulozo - latenta infekto. La moderna koncepto de TB infekto sugestas ke el cent homoj, kiuj estis en kontakto kun M. tuberkulozo, naŭdek bone povas esti infektitaj, sed nur dek el ili estas aktiva malsano estas evoluinta. Aliaj havas TB imuneco, kaj pro naŭdek procentoj de la kazoj la infekto restas latenta. Detekti mastro ĝi helpis molekula genetika metodo.

Genetikistoj diri ke kvindek kvin procentoj de tiuj, kies kultivaĵoj patologian materialo estis negativaj, okdek procentoj de personoj infektitaj de M. tuberkulozo, sed fluas sen radiographic demonstracioj de malsano, PCR pozitiva respondojn ricevis. Estas genetika diagnoza metodo helpis identigi pacientojn ĉe risko por PCR studoj, kun la rezultoj de liaj analizo (mikroskopio kaj kulturo) estis negativaj, kaj subclínicas infekto M. tuberkulozo ĉeestis.

modernaj esploroj

La Rusa Federacio kaj bakteriologiaj laboratorioj uzas akcelita metodo de absoluta koncentriĝoj: nitrato reductasa aktiveco de micobacterias provita de Griess reactivo. Kontraŭ-TB centroj uzas metodon kiu permesas determini drogon rezisto. Ĉi semitaj en likva amaskomunikilaro, kie aŭtomata radiométrica kaj fluoreskaj librotenado sistemo kresko de micobacterias. Tia analizo estas farita rapide - ĝis du semajnoj.

Nuntempe, novaj metodoj estas evoluintaj: drogon rezisto de micobacterias estas mezurata en la genotipo nivelo. Studo de la molekula mekanismoj de rezisto genoj kaj montras la ĉeeston en micobacterias. Tiuj genoj estas rilataj al rezisto al certaj medikamentoj. Ekzemple, Kasa genoj, Inha, katG imuna al isoniazid, rpoB geno - rifampicin 16Sp RNA genoj kaj rpsL - streptomycin, emb1 - por ethambutol, gyrA - a fluoroquinolone ktp.

mutacioj

La moderna diagnozo signife pliigis la molekula-genetika nivelo metodo por studi DNA kaj permesis realigi grandskalajn studojn de mutacioj en sia tuta spektro. Nun ni scias, ke la plej ofta mutacioj en la 516, 526 kaj 531 codones la rpoB geno, kaj identigita la rezisto al diversaj medikamentoj. Estas tuta gamo de metodoj por la tajpado de micobacterias uzante ne nur tradiciajn metodojn - biokemio, biologiaj kaj kulturaj, sed ankaŭ vaste uzata modernaj molekula genetika teknikoj. Jam estas adekvata kaj provizi la korekta diagnozo metodo por la detección de monogenic malsanoj. Ili estas bazitaj sur DNA studoj en la ĝusta areo de aparta geno. Tio estas kutime kompleksa procezo, tempo konsumanta kaj altekosta, sed la datumoj kiuj estas provizita per molekula genetika analizo, estas multe pli preciza kaj informa ol la datumoj de ĉiuj aliaj analizoj.

Ĝi estas delonge konata, ke la DNA ne ŝanĝas por la tuta vivo de la organizaĵo kiu estas en ajna nucleadas ĉeloj odnakova, kaj ĉi ebligas preni la analizo de absolute ĉiuj ĉeloj de la korpo, en ĉiu stadio de ontogenia. La difektita geno eblas detektitaj antaŭ la apero de la unuaj simptomoj de la plenskala klinikaj malsano, kaj ankaŭ en sana heterocigotas homoj, sed havanta mutacio en la geno. Molekula genetika hereda malsano diagnozaj metodoj permesas malkaŝi lian (rekta aliro, DNA-diagnozo), kaj ankaŭ por analizi la apartigo de la malsano en la familio kun markilo loci DNA (genetika polimorfismos), kiuj estas proksime ligitaj kun difektita geno (kio estas, la nerekta aliro de DNA-diagnozo). Rekte aŭ nerekte - ĉiu DNA diagnozo estas bazita sur la metodoj de identiganta strikte difinita parto de la homa DNA.

rekta metodoj

Rekta metodoj de DNA diagnozo estas kiam la kulpulo gene hereda malsano estas konata, tiel konata, kaj tipojn de lia mutacioj. Ekzemple, taŭgan rekta metodoj en kelkaj malsanoj. Tiu Huntington chorea (etendo CTG-ripetoj), phenylketonuria (R408W), fibrosis fibrosis (delF508, gravaj mutacioj) kaj similaj. La ĉefa avantaĝo de la rekta metodo estas tute-posedita diagnoza precizeco, kaj ne necesas fari DNA analizo de la resto de la familio. Se mutacio en la responda geno estas trovita, ĝi permesas ĝuste aprobas diagnóstico de heredaĵo, genotipo determino por la resto de la ŝarĝite familio.

Alia avantaĝo de rekta diagnozo estas konsiderata identigi heterocigotas portanto de malbonaj mutacioj de parencoj kaj gepatroj, kiuj mortis de la malsano. Tio estas aparte vera por malsanoj aŭtosoma recesiva. Malavantaĝoj de rekta metodoj ankaŭ estas disponeblaj. Apliki ilin, vi bezonas scii precize lokalizi la eksternorma geno, Exon-intrón strukturo de ĝia spektro kaj ĝia mutacioj. Ne ĉiuj monogenic malsanoj hodiaŭ ricevis tian informon. Informativeness rekta metodoj ne povas konsideri kompleta, ĉar unu sama geno povas havi grandan nombron de patologia mutacio kiu kaŭzas evoluon de heredaj malsanoj.

nerektaj metodoj

Nerektaj metodoj en DNA diagnozo estas uzataj entute, en aliaj kazoj, se la difektita geno ne identigita, sed nur chromosomally, aŭ se la linio diagnozo ne donis la rezulton (okazas, se la geno kompleksa molekula organizo aŭ en granda parto, se estas multa patologian mutacioj). Nerektaj metodoj farita apartigo analizo de plurformaj markiloj en alélicas familio. Markiloj trovitaj en la sama cromosómico regiono aŭ locus estas proksime ligita al la malsano kaj reprezenti forigoj aŭ inserciones, punkto anstataŭoj, ripetoj, kaj iliaj polimorfismo estas pro malsama kvanto de ĉeloj en la bloko.

Plej oportuna por nerekta diagnozo konsiderita microsatellite kaj minisatellite polimorfismos, kiuj estas vaste distribuita en la homa genaro. ilian valoron esprimita en alta informon enhavo, se damaĝo al la genetika distanco inter la markilo kaj la geno estas ne tro granda. En la lasta kazo, la korinklino ĝusteco estas difinita en granda parto la ofteco de rekombino inter la polimórficos markilo kaj damaĝo. Nerekta diagnozaj metodoj ankaŭ provizi deviga prepara paŝo de alelo oftecoj de la analizitaj loĝantaro studo inter pacientoj kaj portantoj de mutacioj, plus la neceso de determini la probablo de rekombino de nonequilibrium kaj adhesión markiloj kaj mutante alelos.

aliaj metodoj

Mallongaj segmentoj de ARN aŭ ADN, tiel kiel ununura geno bildigita sub mikroskopa studo ne povas esti do identigi mutaciojn devita de molekula genetika diagnozo. Estas "Human Genome Project", kaj ankaŭ aliaj progresoj en molekula genetiko tre vastigita la eblecon de la diagnozo de heredaj malsanoj - ambaŭ antaŭ kaj postnatal. Ĉi tiuj metodoj povas provizi frua detekto kaj fari antaŭdiron poly- kaj monogenic malsanoj, kies debuto okazas en la plenaĝa aĝo. Bedaŭrinde, pro la teknikaj kapabloj de molekula genetika studoj estas foje preter la etikaj limoj kiuj estas en rilato al heredaĵo, speciale kiam la diagnozo estas en adolescencia kaj infanaĝo.

Struktura kaj nombra cromosómico anomalioj estas la plej komunaj kaŭzoj de malsano kaj kancero, kaj multaj misformoj. Cromosómico aberacioj devas esti identigitaj, kio estas grava por familio counseling - por taksi la prognozon, apud reprodukta risko estonte gravedecoj. Kromosomo analizo estas la "ora normo" de genetika diagnozo, sed estas limigita. Nur la metodoj de molekula genetika analizo povas fari pli, ĉar uzata klonado teknologio bazita fluoreska etikedoj kapablas sian altan sentemon identigi subtilaj cromosómico ŝanĝojn kiuj estas neeblaj de detekti klasika citogenéticas studoj. Ĉi tiuj teknikoj estas ĉiam pli vastiganta nian diagnozaj kapabloj, kiam ekzamenita, infanoj kun evoluaj handikapoj, mensa malfruo, kun multaj aliaj heredaj malsanoj.

trovoj

Estas tre grave por la homaro estis la gene strukturon kaj funkcion de scio, tipoj da variado, la kapablo trovi heredaj malsanoj kiuj okazis lige kun la evoluo de molekula genetiko. lia metodoj estas direktitaj al la studo de la molekulo de ADN - kaj kiam ĝi estas normala, kaj kiam ĝi estas difektita. Preparado de acida desoxirribonucleico sekvencoj de nucleótidos (DNA) etendiĝas en stadioj de ricevi specimenojn por identigi individuajn fragmentoj. Izolado de genomic DNA de la ĉeloj, limigo (ŝirante), amplificación (klonado), elektroforezo de la fragmentoj (disigante iliajn elektra ŝargo kaj molekula pezo de agarose ĝelo). Identigo de specifaj fragmentoj lokita sur la surfaco de diskreta strio.

Tiam akiranta en la ago specialaj filtriloj, tra kiu pasas ĉiu fragmento hibridiĝo kun klonita DNA fragmentoj aŭ sintezaj radioaktiva sondas estas kontrolo, kiu estos egala al unu la testo specimeno. Se vi ŝanĝas la pozicion aŭ longo kompare kun la enketo, se nova fragmento aŭ malaperis - ĉiuj ĉi sugestas ke la analizitaj gene suferis restrukturado en la nucleótidos sinsekvo. Ekzistas ok bazaj teknikoj de molekula genetika studoj: secuenciación (determino de DNA), PĈR (kresko de la nombro de sekvencoj), la preparado de manlibroj konataj genoj, DNA klonado, produktado de recombinante molekuloj derivita proteinojn pro recombinante molekuloj, krei kompletan aron (kolekto biblioteko) klonita fragmentoj kiuj akiris uzante limigo.