Fluorescencia mikroskopio: principoj de la metodo

Absorción kaj re-emisión de lumo pli neorganikaj kaj organikaj fluidoj estas la rezulto de fosforescencia aŭ fluorescencia. La diferenco inter la fenomenoj estas la daŭro de la tempo inter absorción kaj emisión de lumo fluo. Kiam la fluorescencia de ĉi tiuj procezoj okazas preskaŭ samtempe, dum fosforescencia - kun kelkaj prokrasto.

historiaj informoj

En 1852, brita sciencisto Stokes, unua priskribis fluorescencia. Li enkondukis novan terminon rezulte de la eksperimentoj kun fluorspar, kiu elsendas ruĝan lumon sub ultraviola lumo. Hejtas rimarkis interesan fenomenon. Oni trovis ke la longitudo de ondo de la fluoreska radiado estas ĉiam pli granda ol la fluo de la ekscito lumo.

Por konfirmi la hipotezon en la 19-a jarcento ekzistis multaj eksperimentoj. Ili montris, ke diversaj specimenoj fluoresce sub la influo de ultraviola lumo. Inter la materialoj, interalie estis kristaloj, rezinoj, mineraloj, klorofilo, kruda drogoj, neorganikaj kombinaĵoj, vitaminoj, oleojn. La rekta uzo de tinkturoj por biologiaj testoj komenciĝis nur en 1930

Fluorescencia mikroskopio: priskribo

Kelkaj de la materialoj uzitaj en la unua duono de la 20-a jarcento studoj elmontris altan specifecon. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Danke al la agado, kiun oni ne povis atingita kontrastaj metodoj, la metodo de fluorescencia mikroskopio fariĝis esenca ilo en biomedicina kaj biologia esplorado. Same grava rezultoj estis akiritaj kaj por materialoj.

? Kio avantaĝojn faras la metodo de fluorescencia mikroskopio? Uzante novajn materialojn iĝis ebla kaj la elekto de tre specifa ĉelo submicroscopic komponantojn. Fluorescencia mikroskopio povas detekti ununuran molekuloj. Gamo da tinkturas permesas la identigon de pluraj aĵoj samtempe. Malgraŭ la limigita spaca rezolucio de la difrakto limo de la teamo, kiu, siavice, dependas de la specifaj proprietoj de la specimeno, la identigo de molekuloj sub ĉi tiu nivelo estas ankaŭ sufiĉe eblas. Diversaj specimenoj post radiado ekspoziciaĵo autofluorescence. Ĉi tiu fenomeno estas vaste uzita en Petrologio, botaniko, la semikonduktaĵo industrio.

trajtoj

Studu besto histojn aŭ patogenoj ofte komplika aŭ tro malfortaj aŭ tre forta unspecific autofluorescence. Tamen, la valoron en studoj akiras enkonduko en la materialo komponantojn ekscitis ĉe specifa ondolongo kaj elsendante la necesajn lumo fluo intenseco. Fluorochromes agi kiel tinkturas kapablas sendepende ligita al strukturoj (videblaj aŭ nevideblaj). Tiel ili havas altan selectividad al la celo, kaj la kvantuma rendimento.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescencia mikroskopio estis vaste uzita ekde la alveno de naturaj kaj sintezaj tinkturoj. Ili posedis iu intenseco profiloj de la emisión kaj ekscito kaj celata al specifaj biologiaj celoj.

Identigo de individuaj molekuloj

Ofte, en idealaj kondiĉoj, Vi povas registri apartan elementon ardo. Por tio, interalie, estas necese provizi sufiĉe malalta sono de la detektilo kaj la optika fono. Fluoresceína molekulo al fiasko pro photobleaching povas elsendi ĝis 300 mil. Fotonoj. Ĉe 20% kolekto efikeco de la procezo kaj povas registri ilin en kvanto de ĉirkaŭ 60 mil.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescencia mikroskopio surbaze lavango fotodiodoj aŭ elektronika multipliko, permesis la esploristoj observi la konduton de individuaj molekuloj tra la dua, kaj en iuj kazoj eĉ minutojn.

komplekseco

Ŝlosila demando favore al la forigo de optika bruo fono. Pro la fakto ke multaj el la materialoj uzitaj en la dezajno de filtriloj kaj lensoj eksponi iuj autofluorescence, la penoj de sciencistoj en la fruaj stadioj estis orientitaj al la produktado de komponaĵoj havanta malaltan fluorescencia. Tamen, postaj eksperimentoj kondukis al novaj konkludoj. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Aparte, oni trovis, ke fluorescencia mikroskopio, bazita sur totala interna interkonsiliĝo, ĝi permesas atingi malaltan fono kaj alta intenseco ekscito lumo.

meĥanismo

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. La principoj de fluorescencia mikroskopio, bazita sur totala interna reflekto estas la uzo de evanescente ondo aŭ evanescente. Ĝi okazas ĉe la limo inter amaskomunikiloj kun malsama refrakta indicoj. En ĉi tiu kazo, la fasko de lumo pasas tra la prismo. Ĝi havas altan indicon de refracción parametron.

La prismo apud la akva solvaĵo aŭ glaso kun malalta parametron. Se trabo de lumo direktita ĝin laŭ angulo kiu estas pli kritika, la trabo estas tute reflektis de la interfaco. Tiu fenomeno, siavice, kaŭzas nonpropagating ondoj. Alivorte, la generita elektromagneta kampo kiu penetras en meza kun pli malalta refrakta indico parametron al distanco malpli ol 200 nanometroj.

La efemera ondo intenseco de la lumo estus sufiĉa eksciti fluorophores. Tamen, pro ĝia ekstreme malgranda profundo, ĝia volumeno estos tre malgranda. La rezulto estas de malalta nivelo fono.

modifiĝo

Fluorescencia mikroskopio estas bazita sur totala interna interkonsiliĝo, povas esti realigita kun epi-lumigado. Tio postulas lensojn kun alta nombra aperturo (almenaŭ 1.4, sed estas dezirinde ke ĝi atingis 1.45-1.6), kaj parte lumigis kampo aparato. Tiu lasta estas atingita per malgranda loko grandeco. Por plej granda unuformeco uzante maldika ringo, kiu estas blokita fare de parto de la fluo. Por la kritika angulo, post kiuj estas tuta pripensado, ni bezonas altan nivelon de refracción de la mergo medio en la lenso kaj la kovrilo glaso de la mikroskopo.